通过Cas9变体扩大CRISPR/Cas9介导的芸苔属基因组编辑的靶向范围

发布时间：2024-06-13 16:15:23 栏目：社会动态

导读 该研究由李军教授(河北农业大学生命科学学院，河北保定)负责。作者利用Cas9变体扩展了CRISPR/Cas9介导的芸苔属植物基因组编辑的靶向性。作...

该研究由李军教授(河北农业大学生命科学学院，河北保定)负责。作者利用Cas9变体扩展了CRISPR/Cas9介导的芸苔属植物基因组编辑的靶向性。作者首先对大白菜(Brassicarapa spp. pekinensis)和卷心菜(Brassica oleracea var. capitata)基因组进行PAM分析，发现Cas9-NG/SpG可能比SpCas9靶向基因组中至少两倍多的位点，而SpRY可以靶向所有具有NNN个PAM的位点。随后，作者构建了CRISPR/Cas9-NG、CRISPR/SpG和CRISPR/SpRY基因编辑系统，并转化到大白菜和卷心菜原生质体中。比较了Cas9-NG、SpG和SpRY变体在不同PAM位点的编辑效率和偏向性。 NGS测序结果显示，Cas9-NG和SpG均能识别芸苔属植物中的多种NGN PAM ，且SpG在NGT和NGC PAM上具有比Cas9-NG更高的编辑效率;SpRY能够靶向附近无PAM的位点，并且在NRN PAM位点的编辑效率高于NYN。



为了评估 SpRY 在植物体内的活性，我们获得了经过编辑的再生卷心菜，结果表明 SpRY 能够以无 PAM 的方式在稳定的卷心菜植株中进行定向诱变。为了在近无 PAM 位点引入精确的腺嘌呤碱基编辑 (ABE)，我们将 SpRY(D10A) 切口酶与 TadA8e 融合，得到 pBSE-SpRYn-ABE8e。PCR/RE 测定和 Sanger 测序证实，SpRY-ABE8e 在大白菜的 NNN PAM 位点实现了有效的 A 到 G 替换。

综上所述，本研究开发了用于识别芸苔属植物中非典型PAM的基因编辑工具箱，大大扩展了Cas9变体基因组编辑的靶向范围，为芸苔属植物未来基础研究和遗传改良奠定了基础。